油品生物脱硫主要是利用某些特殊微生物对燃料油中含硫化合物有极高利用或分解能力这一特点，使存在于油中不溶于水的含硫化合物在生物催化剂的作用下变成水溶性的化合物，从油中分离出来。油品的生物催化脱硫是一个复杂的多相反应，其脱硫效率不仅受到生物催化剂的选择性、稳定性、活性和寿命等因素的影响；同时由于底物在水中的溶解度极小，传质限制也是影响脱硫效率的主要因素之一；在好氧脱硫过程中还涉及到氧气在液相和微生物细胞中的扩散和传递。因此，生物脱硫要实现工业化应用，在进一步开发新菌种，改善菌种性能的同时，还需要对微生物的脱硫速率、反应程度、反应动力学及过程控制等进行深入的研究[1-4]。
本研究使用具有自主知识产权的，通过原生质体融合获得的脱硫细胞工程菌，考察了该菌种对有机硫化合物的代谢情况，并获得了该微生物的脱硫反应动力学方程，期望能为实现我国油品生物脱硫技术工业化提供可借鉴的理论依据。
细胞工程菌：实验中使用的细胞工程菌来源于正突变枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis Subsp.)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus Fresen.)双亲本融合细胞，即脱硫细胞工程菌，标记为R1TLYQM。枯草芽孢杆菌和烟曲霉是从天津大港油田被原油污染的土壤中驯化、分离得到，对多种复杂有机硫化合物具有一定脱除能力，已经中国科学院微生物研究所鉴定。
实验中使用的主要试剂二苯并噻吩(dibenzothiophene，DBT)、2-羟基联苯(2-hydroxy biphenyl，2-HBP)为ACROS公司产品；正十六烷为HALTERMANN公司产品；青霉素为SIGMA产品；色谱纯甲醇为北京化学试剂厂产品。
实验中使用的主要培养基为无机盐培养基、普通培养基、富集培养基等[5]。
无机盐培养基：KH2PO4 0.5 g、K2HPO40.5 g、MgCl2 0.2 g、CaCl2 0.1 g、NaCl 0.2 g、Mn(NO3)2痕量、FeCl2痕量、NH4NO3 1.0 g，去离子水1 000 mL。
普通培养基：蔗糖30 g、NaNO3 3 g、K2PO4 1 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4 0.01 g、青霉素4×105U、去离子水1 000 mL。
富集培养基：葡萄糖20 g、MgSO41.5 g、KH2PO4 3 g，青霉素4×105U，20%马铃薯浸汁1 000 mL。
种子液溶剂：葡萄糖20 g、MgCl21.5 g、KH2PO4 3 g、青霉素4×105U、去离子水1 000 mL。
除无机盐培养基外，其余的培养基在使用过程中均经过0.15 MPa，121 ℃，20 min的蒸汽灭菌。
青霉素在使用时经过滤除菌后加入到灭菌后的培养基内。
LiFlus GX发酵系统使用韩国百特伦公司产品；Airstream S-Series Ⅱ级生物安全柜使用Esco Micro Pte Ltd公司产品；不锈钢立式灭菌器使用上海申安医疗机械厂产品；LGR16-W型高速冷冻离心机使用北京京立离心机厂产品；CL3010高效毛细管电泳液相色谱一体机使用北京彩陆科学仪器有限公司产品。
种子液制备：冷冻干燥保存的R1TLYQM，32 ℃、搅拌速度130 r/min富集培养一级种子，进入对数生长期后，按40 %量进行接种，32 ℃、搅拌速度130 r/min二级种子培养24 h后，15 ℃、搅拌速度6 000 r/min离心5 min分离收集菌体。菌体经种子液溶剂3次洗涤后，将R1TLYQM悬于种子液溶剂中制备成0.5 g/mL的菌悬液，即为种子液。
发酵罐容积5 L，装液系数0.75，发酵罐内装液3.6 L，油水体积比为1:5，20 %生物接种量(种子液)，即油相分别为含300 μg/mL和500 μg/mLDBT的正十六烷溶液600 mL，水相无机盐培养液2 400 mL和种子液600 mL。搅拌速度300 r/min，通气量9.5 cm3/min，30 ℃；pH值恒定6.5(发酵系统在线监测发酵液pH值变化，当pH值发生变化时，自动启动储有NaHCO3或醋酸的补料瓶进行酸碱调控)，进行24 h和96 h的发酵脱硫实验。发酵脱硫过程中，每3 h和6 h取油相进行液相色谱分析，并测定水相中R1TLYQM的量。水相中R1TLYQM的量采用15 ℃、6 000 r/min离心5 min条件下，分离收集菌体称湿重的方法确定。通过观察DBT的消耗与R1TLYQM生长的关系，以及培养液中其它代谢物的情况，可初步获得R1TLYQM代谢DBT的终产物，并初步获得R1TLYQM代谢不同浓度DBT的动力学参数。
DBT和2-HBP的含量采用高效液相色谱法测定。
高效液相色谱仪的使用条件及方法：高效液相色谱仪配置C18、30 cm色谱柱，紫外检测器，20 μL定量阀。选择正十六烷作为硫化合物的溶剂，检测波长为254 nm，流动相100%甲醇的流速为1 mL/min，柱温为25 ℃，进样量20 μL。在此条件下，用外标法测定DBT和2-HBP含量
2-BHP、DBT标准品、空白对照和R1TLYQM代谢500 μg/mLDBT 72 h的高效液相谱图见图 1~图 4。
由图 1和图 2可知，2-HBP的保留时间为3.251 min，DBT的保留时间7.515 min。图 3显示，较明显出峰处的保留时间是3.435 min和7.603 min。经过多次平行测定，考虑仪器的稳定性和实验误差等因素，可以认为图 3中保留时间7.603 min为DBT，3.435 min处为2-HBP，可以认为R1TLYQM代谢DBT的终产物为2-HBP。R1TLYQM在代谢DBT过程中，随着DBT的降低，R1TLYQM细胞的量相应增加，同时发酵系统内DBT是唯一硫源，硫是细胞生长所需元素，可以初步认为硫参与了R1TLYQM细胞的生物合成。
细胞生物反应过程，包括细胞的生长、底物的消耗和代谢产物的生成。在研究脱硫细胞工程菌代谢DBT动力学过程中，考虑到菌体的生长特性、脱硫特性及与2-HBP的关系，通过环境条件的控制，使脱硫细胞工程菌在反应器内呈类似单细胞悬浮式生长，并对菌体代谢DBT过程进行简化：①细胞生长为均衡生长，描述细胞生长的变量为细胞量；②培养基中只有一种底物是生长限制性底物，而其它组分为过量，不影响细胞的生长；③细胞反应视为简单的单一反应，细胞得率为一常数；同时2-HBP的生成与细胞生长部分相关。故采用式(1)描述R1TLYQM代谢DBT细胞生长动力学模型；式(2)描述DBT消耗的动力学模型；式(3)描述产物2-HBP生成动力学模型[8-9]。
R1TLYQM代谢DBT动力学实验结果见图 5和图 6。
由图 5和图 6可知，油水体积比1:5，20 %的生物接种量，搅拌速度300 rpm，通气量9.5 cm3/min，37 ℃；pH值恒定6.5(发酵设备在线自动监测pH值的变化，当发酵液的酸碱性发生改变时，设备自动启动储有NaHCO3和醋酸的补料瓶调节pH值)；进行24 h和96 h的间歇发酵脱硫实验过程中，体系内无其它含硫物质，可以初步认为，DBT中的硫参与了脱硫细胞工程菌的生物合成，随着DBT的减少，2-HBP逐渐增多，并且2-HBP的合成与脱硫细胞工程菌的生长呈部分相关，说明2-HBP并非完全是细胞代谢DBT的初级和次级代谢产物。该脱硫细胞工程菌代谢DBT的具体途径及机理有待进一步深入研究。依据图 5和图 6实验数据，进行数据转换，利用最小二乘法，分别对所要求取得的动力学参数求导数，令其微分方程等于零，得到一组代数方程，解方程组并利用双倒数作图等方法，获得R1TLYQM代谢不同浓度DBT的动力学参数见表 1。R1TLYQM代谢初始DBT300 μg/mL浓度动力学方程见式(4)~式(6)，代谢初始DBT500 μg/mL浓度动力学方程见式(7)~式(9)。
由表 1可知，R1TLYQM代谢300 μg/mLDBT时，最大比生长速率高于代谢500 μg/mLDBT，细胞生长饱和常数低于代谢500 μg/mLDBT，说明实验中使用的R1TLYQM更适于代谢低浓度的硫化合物。同时R1TLYQM代谢300 μg/mLDBT时，与细胞生长相关的产物生成系数和与细胞浓度相关的产物生成系数均优于R1TLYQM代谢500 μg/mLDBT。进一步说明R1TLYQM对低浓度的DBT有很好的亲和力及脱除能力。
(1) 实验使用菌源为具有脱硫能力正突变的枯草芽孢杆菌和丝状生长的烟曲霉进行原生质体融合后，获得的具有双亲性状的脱硫细胞工程菌。该细胞工程菌代谢DBT的终产物主要为2-HBP。该菌株在代谢不同浓度DBT进行24 h和96 h的间歇发酵脱硫实验过程中，体系内无其它含硫物质，可以认为，DBT中的硫参与了脱硫细胞工程菌的生物合成，随着DBT的减少，2-HBP逐渐增多，并且2-HBP的合成与细胞的生长呈部分相关。
(2) 该细胞工程菌代谢油相正十六烷中300 μg/mLDBT时，细胞生长动力学方程为u=，DBT消耗动力学方程为，2-HBP合成动力学方程为qp=0.027μ+0.013；代谢油相正十六烷中500 μg/mLDBT时，细胞生长动力学方程为，DBT消耗动力学方程为，2-HBP合成动力学方程为qp=0.024μ+0.026，其对低浓度的DBT有很好的亲和力及代谢能力。该细胞工程菌代谢DBT动力学方程的获得，对生物脱硫工艺过程的优化，提高脱硫效率有一定的理论指导意义。
符 号 说 明
μ为细胞比生长速率，h-1；μmax为最大比生长速率，h-1；KS1为细胞生长饱和常数，μg/mL；KS2为DBT消耗饱和常数，μg/mL；S为限制性底物DBT浓度，μg/mL；qs为限制性底物的比消耗速率，h-1；qs,max为限制性底物的最大比消耗速率，h-1；qp为产物的比生成速率，h-1；α为与细胞生长相关的产物生成系数；β为与细胞浓度相关的产物生成系数。
2011, Vol. 40 Issue (4): 351-354，389
2011, Vol. 40 Issue (4): 351-354，389