三元复合驱是一种强化采油技术，但由于三元复合体系中碱的作用使采油所产生的污水中含有大量的胶状悬浮固体及油珠，乳化稳定性比较强，致使污水处理难度加大。絮凝法是处理含油污水的重要方法之一，但目前处理含油污水的絮凝药剂用量大，且危害生态环境[1-2]，于是国内外科研人员开始考虑将微生物絮凝剂应用在石化废水的处理过程中[3]。微生物絮凝剂是继无机絮凝剂和有机絮凝剂之后出现的一种新型的、自然降解的水处理剂，它具有高效、无毒、无二次污染的特点，与当今世界环境污染问题治理的要求一致[4-6]。
本实验针对三元复合驱采出液污水的特征从油田采出液污水中筛选出一株高活性微生物絮凝剂产生菌，并对其进行了菌种鉴定，同时研究了微生物絮凝剂的投加量及产絮菌的培养时间对絮凝活性的影响，分析了微生物絮凝剂的活性物质成分，重点考察了该微生物絮凝剂对三元复合驱采出液污水的处理效果。
筛选分离的样本来源：大庆油田采油一厂217试验站采出液污水。
污水水样：三元复合驱采出液污水，水样特性见表 1。
微生物培养基：
(1) LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母提取物5、氯化钠(NaCl)10、琼脂18、pH值7.4；
(2) 查氏培养基(g/L)：蔗糖30、NaNO3 3、K2HPO4 1、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4 0.01、琼脂18、pH值自然。
MLS-3020-三洋全自动高压蒸汽灭菌器(日本三洋集团)；Sigma3K15高速冷冻离心机(德国SIGMA公司)；WGZ-200型散射式浊度仪(上海光学仪器一厂)；UV-2000紫外分光光度计(尤尼柯(上海)仪器制造厂)；Magna-IR560ESP红外光谱仪(美国Thermo Nicolet公司)；Zeta sizer Nano ZS 90激光粒度仪(英国马尔文仪器有限公司)。
(1) 菌种的分离筛选：取1 mL分离样本于LB培养基中富集培养48 h后，取1 mL发酵液用无菌水依次稀释到106倍以上，涂布于固体LB平板，35 ℃恒温培养36 h后，观察菌落生长情况，挑取粘稠、表面光滑湿润的单菌落，转接到查氏培养基中，于35 ℃、170 r/min摇床振荡培养36 h。培养结束后，取适量发酵液加入到三元复合驱采出液污水中，测定其絮凝活性，筛选出活性高的菌种WZ分别置于4 ℃和-80 ℃保藏。
(2) 微生物絮凝剂产生菌菌种鉴定：对微生物絮凝剂产生菌WZ进行革兰氏染色、生理生化和16S rDNA全长序列分析。采用单个菌落PCR技术，引物P0：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’、P6：5’- CTGAGCCAGGATCAAACTCTC -3’，总反应体积为50 μL，反应体系包括：双蒸水23 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL和2×MasterMix 25 μL。反应程序是：95 ℃预变性3 min 30 s；95 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸4 min，30循环。得到的PCR产物由上海生工进行测序。在NCBI上对测得的16S rDNA序列进行BLAST，找出最相似序列及最相似序列的分类情况，并利用MEGA5软件对测得的序列进行系统发育树构建，分析其系统进化情况。
(1) 絮凝效果测定：激光粒度仪测得的粒度为体积粒径值，在物质均匀的溶液中，该粒径值与溶液中物质的重量存在一定关系，因此本实验在100 mL三元复合驱采出液污水中加入适量微生物絮凝剂，搅拌3 min后静置1 h，采用激光粒度仪测定处理后采出液污水上清液的粒度，用未处理的采出液污水作对照，间接检测采出液污水中悬浮物含量变化。
(2) 悬浮物固体去除率的计算：在100 mL三元复合驱采出液污水中加入适量WZ微生物絮凝剂，搅拌3 min后静置1 h，观察出现较大絮体，用4层纱布过滤掉絮体，采用悬浮物国标测量法[7]测定处理后的采出液污水的悬浮物质量，用未加絮凝剂但经过滤的采出液污水作对照。悬浮物固体去除率的计算公式：悬浮物固体去除率=[(A-B)/A]×100%。其中，A为未加絮凝剂但经过滤采出液污水的悬浮物质量；B为WZ微生物絮凝剂处理后的采出液污水的悬浮物质量。
(1) WZ微生物絮凝剂粗提：发酵液5000 r/min离心5 min，去除沉淀(菌体和杂物)；收集上清液，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，10 000 r/min离心10 min，收集沉淀；此沉淀物用超纯水溶解，加入0.5倍体积的氯仿和正丁醇的混合液(5:2)，振荡，5 000 r/min离心10 min，反复数次，收集上清液。将上清液倒入截留分子量14 000透析袋内透析2天，70%乙醇洗涤沉淀；真空干燥，得到絮凝剂粗制品。
(2) 采用蒽酮比色法对WZ微生物絮凝剂的糖含量进行测定[8]；采用考马斯亮蓝法对WZ微生物絮凝剂的蛋白质含量进行测定[8]。
(3) 利用红外光谱分析仪分析WZ微生物絮凝剂的所有特征基团，以1% KBr压片法测定。
本实验经分离纯化共筛选到137株菌，对三元复合驱采出液污水具有絮凝活性的菌株为3株，经复筛和传代培养后，得到一株具有良好稳定絮凝活性的菌株WZ。该菌经LB培养基平面培养后，菌落呈乳白色，表面凸起、光滑，不透明，边缘整齐，菌落大小2 mm~3 mm。
利用透射电镜对菌体进行观察，如图 1所示，WZ菌为棒状短杆，大小为(0.5~1.0) μm×(1.0~3.0) μm，有鞭毛，有荚膜，通过生理生化分析WZ菌为产酸产气革兰氏阴性菌。
采用16S rDNA的通用引物，在最佳的PCR条件下扩增出WZ菌的16S rDNA序列1465bp，将此序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST，得知WZ菌与Pantoea agglomerans strain WAB1870同源性最高，达到100%。从比对结果中选择与菌株WZ同源性相近的16个菌种的16S rDNA构建系统进化树，如图 2所示，可以看出WZ菌与Pantoea agglomerans strain WAB1870亲缘关系最为接近，综合分析确定WZ菌为成团泛菌(Pantoea agglomerans)。
将发酵液5000 r/min离心5 min，分别测定发酵液、离心后去菌体细胞的上清液和离心后用去离子水悬浮菌细胞的菌悬液的絮凝效果，结果如图 3。可见微生物絮凝剂的有效成分主要分布在发酵液离心后的上清液中，说明这种絮凝剂物质应该是菌体的代谢产物，而不是菌体本身。
将WZ菌以0.4%的接种量接种于查氏培养基中，于35 ℃、170 r/min摇床振荡培养36 h，取发酵液5000 r/min离心5 min，收集上清液，向100 mL三元复合驱采出液污水中分别加入1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL、3 mL、3.5 mL和4 mL，静置1 h后，测定各个投加量的絮凝效果。微生物絮凝剂的使用都有一个最佳投加量，过多过少都影响其絮凝活性[9]。如图 4可知，WZ微生物絮凝剂对三元复合驱采出液污水的絮凝效果并不是随着加入量增加而不断提高的。投加量在1 mL~2.5 mL之间时，采出液污水的平均粒度呈下降趋势，说明絮凝效果逐渐变好，这是由于随着絮凝剂的投加量增多，絮凝剂中的粘性物质增加，有利于吸附污水中的颗粒；投加量在2.5 mL~4 mL之间时，采出液污水的平均粒度呈上升趋势，絮凝效果变差。由絮凝原理可知，如果投入高分子絮凝剂过量，胶体颗粒将被过多吸附的聚合物所包围，反而会失去同其他微粒架桥结合的可能性，处于稳定状态[10]。因此，投加量在25 mL/L时，絮凝效果最理想。
将WZ菌按0.4%的接种量接种于查氏培养基中，于35 ℃、170 r/min摇床振荡培养，每隔3 h测定发酵液的OD600，培养17 h后，每隔3 h(17 h、20 h、23 h、26 h、29 h、32 h、35 h、38 h、41 h、44 h、47 h、50 h、53 h)测定一次絮凝效果。如图 5可看出，WZ微生物絮凝剂对三元复合驱采出液污水的絮凝效果与菌体的生长情况有关，WZ菌产微生物絮凝剂的最佳生长时间为29 h。当菌体处于对数生长期时，菌体的絮凝活性逐渐增强；当菌体浓度接近最大时，絮凝效果达到最好；当菌体处于稳定期，絮凝活性略有减弱；当菌体进入衰亡期时，絮凝活性迅速减弱，失去了原有的絮凝活性。说明絮凝活性物质是菌体生长过程中的中间代谢产物，而不是菌体的最终代谢产物和菌体自溶物质。
WZ菌以0.4%的接种量接种于查氏培养基，于35 ℃、170 r/min摇床振荡培养29 h，取培养后发酵液离心后的上清液2.5 mL对三元复合驱采出液污水进行处理，分别测定其经上清液处理且过滤和未经上清液处理但过滤的三元复合驱采出液污水的悬浮物质量和浊度值，数值见表 2。根据表 2数值，采用称重法计算其悬浮物固体去除率为47.76%，同时其浊度降低率为44.74%。
经纯化得到的WZ微生物絮凝剂呈纯白色，稀松多孔，质地轻，轻捻略带粘性的粉末状固体。溶于纯水时，溶液似浓糖水样带有粘度。经蒽酮比色法测得的WZ微生物絮凝剂含糖质量分数为59.13%；经考马斯亮蓝法测得的WZ微生物絮凝剂含蛋白质质量分数为6.75%。对WZ菌产生的絮凝剂进行纯化分离后的产物进行红外吸收光谱分析，其红外吸收光谱图如图 6所示。由图 6可知，纯化分离产物的红外吸收光谱图有7个明显的吸收峰，吸收峰出现的位置分别为3391 cm-1、1655 cm-1、1236 cm-1、1068 cm-1、1025 cm-1、883 cm-1、595 cm-1。其中3391 cm-1附近的强宽峰是分子间或分子内的O-H伸缩振动峰，表明该产物存在分子间和分子内氢键；1655 cm-1的强尖峰可能是酰胺键中的C=O(—CHO)的伸缩振动峰；1236 cm-1的小尖峰是C-O(-COO)的伸缩振动峰，显示产物中可能含有酯基；1200 cm-1~1000 cm-1间比较大的吸收峰(1069 cm-1和1025 cm-1)是所有糖类物质的典型吸收，是两种C-O伸缩振动引起的，其中一种属于C-O-H的，另一种是糖环的C-O-C；883 cm-1处的微弱吸收峰可能是β-型异构体，这表明在该糖类物质中出现了β-糖苷键。另外，1600 cm-1出现的微弱吸收峰可能是酰胺键中的C=O的伸缩振动，是蛋白质的吸收特征。该红外吸收光谱图表明WZ微生物絮凝剂主要是糖蛋白类物质。
(1) 从油田采出液污水中筛选出1株产高效微生物絮凝剂的菌株WZ，该菌为棒状短杆，有鞭毛，有荚膜，产酸产气革兰氏阴性菌；经16S rDNA测序及系统发育学分析确定WZ菌应为成团泛菌(Pantoea agglomerans)。
(2) WZ菌产絮凝剂的最佳培养时间为29 h，絮凝剂的最适投加量为25 mL/L，其悬浮物固体去除率为47.76%，其浊度降低率为44.74%。
(3) 经红外吸收光谱分析及糖类和蛋白质类物质含量测定得知：WZ微生物絮凝剂主要成分为糖蛋白类物质。
2012, Vol. 41 Issue (3): 341-345
2012, Vol. 41 Issue (3): 341-345