微生物采油技术(MEOR)[1-2]主要应用微生物细菌在油田中的代谢过程, 产生有利于提高采油率的代谢产物或者直接改善原油物化性质, 从而提高油田三次采油采收率的方法。与其他的三次采油技术相比, 具有成本低、污染小、经济效益高等优点, 在三次采油中具有广阔的应用前景[3-4]。应用微生物三次采油一般可增产10%~46%[5]。菌种单一、提高采收率功能强的优质菌种不多是目前MEOR存在的主要问题。因此, 性能优良的采油微生物的筛选及培养基的条件优化是决定微生物正常生长繁殖及提高原油采收率的关键因素。枯草芽孢杆菌是目前驱油效果较好的一类微生物, 其代谢产生脂肽类表面活性剂可显著降低油水界面张力, 还能使烃类物质吸附到微生物细胞表面, 促进微生物吸收和降解疏水性的有机物; 能改变岩石等表面的润湿性, 具有较强的乳化能力, 具备在油田应用的前景[6]。本实验主要对一株枯草芽孢杆菌代谢产生物表面活性剂的发酵条件进行工艺优化, 获得富产生物表面活性物质的发酵液。考察枯草芽孢杆菌对原油的乳化降解性能, 并且模拟地层条件进行微生物驱油试验, 从而准确评估该菌株以外源注入式应用于三次采油的能力。
枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtili编号32811)由甘肃省微生物保藏中心提供, 在4 ℃下冷冻保藏, 每3个月接种一次。实验中适合微生物生长的无机培养基中各种无机组分含量参照文献[7], 并做微调, 其组成如下(g/L):ρ(葡萄糖)30.0, ρ(NH4NO3)1.0, ρ(KH2PO4) 4.1, ρ(Na2HPO4·12H2O)14.3, ρ(MgSO4)0.096, ρ(CaCl2)0.000 8, ρ(FeSO4)0.001 1, ρ(C10H16N2Na2O8)0.001 5。
实验中使用化学试剂包括石油醚(30~60 ℃), 正庚烷, 甲苯, 甲醇, 二氯甲烷等, 均为分析纯, 西陇化工股份有限公司提供。硅胶(0.05~0.075 mm), 青岛海浪硅胶干燥剂有限公司提供, 中性氧化铝(0.05~0.075 mm), 国药集团化学试剂有限公司提供。实验中所用水为超纯水(18.25 mΩ·cm)。原油由长庆油田提供, 属中黏度原油。
将保存在斜面上的枯草芽孢杆菌用接种环以划线形式植入已经过间歇式灭菌处理、其内装有100 mL无机培养基的250 mL三角瓶中, 在30 ℃、120 r/min的条件下培养。经过60 h的培养, 获得新鲜菌液。将5%的新鲜菌液离心去除清液后, 用无机培养基洗涤三次, 然后转接入已灭菌含有150 mL培养基中, 于30 ℃、120 r/min的摇床中振荡培养。
应用UV-2000紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)定时测定细菌悬浮液在600 nm下的吸光度值[8], 并记录数据, 绘制菌株生长曲线。利用悬滴法界面张力仪(上海中晨数字技术有限公司)测试上清液的表面张力。测试中, 每个样品平行测3次, 取平均值。实验前先用纯水做校正。
确定最佳培养基配方时, 分别改变接种细菌的含量, 每隔12 h测量培养液的吸光度、表面张力, 从而确定最优接种量。
参考文献[9]分别采用甘油、葡萄糖、菜籽油和柠檬酸三钠进行碳源种类筛选, 确定最优碳源及含量。然后在该碳源含量下, 采用硝酸铵、尿素和硝酸钠进行氮源种类筛选, 确定最优氮源及含量。
摇床振荡培养一定时间后, 离心分离获得上层油相, 加入20 mL石油醚, 转至分液漏斗萃取, 振荡1 min, 静置, 待分层后分离, 收集上层液, 用石油醚洗涤2~3次, 合并油相并用无水硫酸钠脱水, 自然干燥至恒量, 称量[10]。原油降解率W的计算如式(1):
式中:m1为对照组的残油质量, g; m2为处理后样品的残油质量, g。
将降解前后的原油进行GC-MS分析, 分析降解前后原油组分的变化。
沥青组成非常复杂, 根据其组成极性和相对分子质量依次增大而分为饱和烃、芳香烃、胶质和沥青质4种组分[11]。根据沥青质不溶于正庚烷而其他3种组分溶于正庚烷的原理, 用正庚烷沉淀法分离沥青质[12]。分离出沥青质后, 将剩余3种组分(maltenes)收集、减压蒸馏、干燥。采用柱色谱法分离, 得到的组分用减压蒸馏去除溶剂, 干燥后称量并计算各组分含量[13-15]。实验重复3次, 取平均值。
筛选砂粒粒径参照文献[16], 小于106 μm(占2.6%), 106~250 μm(占48.1%), 250~450 μm(占34.7%), 450~900 μm(占9.2%), 大于900 μm(占5.4%), 清洗沙子除去泥土及相关杂质, 在500 ℃的条件下灼烧3~4 h, 将不同粒度的沙子混合均匀, 放入填砂模型中。
模拟地层水组成参照文献[17], 如表 1所示:
参照文献[18]进行驱油实验, 驱油步骤如下:
(1) 柱塞计量泵以3 mL/min向填砂模型中注入地层水, 直至注入水与流出水体积相同为止。
(2) 以2 mL/min注入原油, 计算岩心的原始含油饱和度[17]。
(3) 以3 mL/min注入地层水, 计算一次水驱采收率。
(4) 以2 mL/min注入微生物菌液。恒温放置3~5天。
(5) 以3 mL/min注入地层水, 计算原油采出率。或将分离出的微生物注入填砂模型中, 再注入无机培养液进行驱油实验, 比较微生物注入前后的地层水驱油效果。
图 1为不同碳源对微生物生长曲线和发酵液表面张力的影响。由图 1(a)可知, 枯草芽孢杆菌可以利用葡萄糖、甘油等碳源进行生长繁殖。以葡萄糖、菜籽油为碳源时, 枯草芽孢杆菌代谢产生的生物量明显优于甘油和柠檬酸三钠。说明枯草芽孢杆菌利用葡萄糖和菜籽油的能力优于甘油和柠檬酸三钠。从图 1(b)可以看出, 葡萄糖作为碳源的培养液表面张力降低最大, 表面张力最低可达到25 mN/m左右。因此, 本实验选择葡萄糖作为碳源。
图 2为葡萄糖浓度对微生物生长曲线和发酵液表面张力的影响。从图 2(a)可知, 随着碳源质量分数的增加, 微生物产生的生物量增加, 吸光度值增加, 其中3%(w, 下同)的葡萄糖培养液中产生的生物量最多。随着葡萄糖浓度继续增大, 培养液的渗透压增大[22], 对细菌的生长产生抑制作用, 导致细菌生物量降低。从图 2(b)可以看出, 当葡萄糖质量分数为1%、3%和5%时, 培养液的表面张力相差不大, 均为约25 mN/m。结合图 2(a), 选择3%的葡萄糖作为碳源进行实验。
图 3为不同氮源对微生物生长曲线和发酵液表面张力的影响。从图 3(a)可以看出, 随着培养时间的延长, 微生物代谢产生生物量增加, 硝酸铵和硝酸钠在60 h吸光度值最大, 说明此时产生的生物量最多。尿素作为氮源的培养基在84 h吸光度值最大, 约为3.5左右, 说明枯草芽孢杆菌均能在上述3种物质为氮源的培养基中正常生长。从图 3(b)可知, 硝酸铵作为氮源比硝酸钠和尿素作为氮源时的表面张力都低。综合考虑, 选择硝酸铵作为氮源进行发酵培养。
图 4为氮源浓度对微生物生长曲线和发酵液表面张力的影响。由图 4(a)可知, 培养基的吸光度随培养时间的延长而增加, 0.1%(w, 下同)硝酸铵为氮源的培养基中吸光度值最大。从图 4(b)知, 不同硝酸铵浓度下的表面张力相差不大, 主要是从吸光度来确定硝酸铵的浓度。细菌在高浓度的氮源培养基中生长速度快, 可能造成碳源和氧气等物质缺乏, 细菌生长速度降低, 进而会逐渐衰亡[19]。因此, 选择0.1%硝酸铵为氮源进行发酵培养。
图 5为接种量对细菌生长的影响。由图 5可知, 不同接种量的培养基的吸光度值随着培养时间的延长均增大, 产生的生物量增多。但相同时间内不同含量的细菌对生长量的影响很小, 原因是与培养液体积相比, 菌龄及细菌本身的生物活性是影响细菌正常生长繁殖的主要因素。因此, 细菌最优接种量为2%(φ, 下同)。
图 6为原油乳化情况。从图 6可以看出, 细菌培养前, 原油浮于培养基表面, 呈片状, 有明显分层现象。培养7天后, 与空白对照相比, 枯草芽孢杆菌进行生长繁殖, 培养基出现浑浊现象, 并且将原油乳化分散, 油液形成细小的油珠, 产生部分油水混相。培养60天后, 原油基本上被完全乳化。说明枯草芽孢杆菌能在原油作为碳源的培养基中生长, 并能乳化降解原油。
根据式(1)计算出培养7天后原油降解率为21.8%。培养60天后原油降解率为83.6%。进一步说明了枯草芽孢杆菌能降解原油。
将经枯草芽孢杆菌处理前后的原油成分GC-MS谱图对比分析(见图 7), 结合积分计算峰面积, 得出原油在微生物处理后重质组分减少, 长链烃类减少。说明枯草芽孢杆菌有降解原油的能力。这与微生物驱油过程中细菌及代谢产物具有降解原油组分等相关机理相符。因此, 该细菌满足微生物驱油菌种所需的条件, 对其在微生物驱油中的应用将做进一步研究。
用正庚烷沉淀法确定该原油中沥青质的质量分数为4.56%。微生物作用后, 原油沥青质组分明显减少, 约为0.5%。从表 2可知, 微生物处理后, 饱和烃、芳香烃含量降低, 胶质含量增加。沥青质组分减少是因为微生物能将重质组分降解。饱和烃、芳香烃含量降低是因为低相对分子质量的正构烷烃能够优先被微生物利用。胶质含量增加可能是因为微生物将沥青质降解为小分子的胶质。因为胶质和沥青质的化学结构和性质相似, 而胶质的相对分子质量较小[14]。
枯草芽孢杆菌物模驱油实验结果如表 3所示。
从表 3得出, 在其他相同条件下, 注入发酵84 h的微生物菌液和直接注入微生物再注入等量无机培养液后, 其采收率有明显的提高, 原油采收率分别提高26.1%和31.4%。注入微生物发酵液主要利用代谢产生的表面活性剂进行驱油。直接注入微生物再注入无机培养液, 使微生物在地层中生长繁殖, 微生物自身及其代谢产物都有利于提高原油采收率。因此, 后者注入方式更有利于提高原油采收率。
(1) 本实验通过单因素分析方法, 确定了枯草芽孢杆菌的最佳培养基配方(g/L):ρ(C6H12O6)30.0, ρ(NH4NO3)1.0, ρ(KH2PO4) 4.1, ρ(Na2HPO4·12H2O)14.3, ρ(MgSO4)0.096, ρ(CaCl2)0.0008, ρ(FeSO4)0.0011, ρ(C10H16N2Na2O8)0.0015。在此条件下, 发酵液表面张力可降至25 mN/m。
(2) 枯草芽孢杆菌能利用原油进行代谢生长, 并对原油有一定的乳化降解作用, 能显著降低重质组分含量, 对轻质组分也有一定的降解作用。
(3) 枯草芽孢杆菌在培养过程中细胞本身及产生的代谢产物具有降低表面张力, 降解原油重质组分等性能, 注入发酵液和微生物后原油采收率分别提高26.1%和31.4%。说明枯草芽孢杆菌符合微生物驱油中采油微生物的要求, 具有提高油藏剩余油采收率的潜力。
2016, Vol. 45 Issue (3): 61-66
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