柴油是从原油中蒸馏分离碳数在C9~C20之间的一种复合碳氢化合物[1]，广泛应用于海洋工程、船舶和农业等方面。柴油在冶炼、运输、储存及其使用等过程中会造成一定的污染[2-3]。目前，柴油污染的处理方法主要有物理法、化学法和生物法[4]，但物理法处理不彻底，化学法易造成海洋环境二次污染，生物法具有降油效果好、成本低和二次污染小等优点，因此，生物法已成为最具有应用前景的石油烃污染的修复技术[5]。然而，迁移及吸附作用会使部分柴油分散到海水中，致使海水中污染物的集中处理成为一个难题。
海绵是一种多细胞滤食性海洋动物，具有较强的泵水能力，可达到170~72 000倍自身的体积，加勒比海的海水几乎每天都可以被海绵过滤一遍[6]。由于海绵自身独特的孔状结构及其巨大的滤食能力，使海绵体内富集丰富的海洋微生物并与之形成海绵共生微生物，这些微生物量占海绵生物量的40%~60%[7]。利用海绵不断泵水的特征，将海水源源不断地泵入其体内，海水中的污染物在通过孔状结构时，有一部分被海绵共生微生物降解[8]，所以，海绵-微生物共生体对海水具有一定的净化能力[9]。可见，从海绵中分离具有降解功能的微生物，对于海洋环境的生物修复具有非常重要的意义。
本研究从海绵中筛选降烃菌株，并对其进行鉴定、复配和响应面优化试验，探讨和分析不同温度、pH值、转速和柴油含量等对目标菌株降烃效果的影响，以期构建具有良好降烃效果的海绵-降烃菌株共生体，从而解决海水中柴油污染物难以集中处理的问题。
海绵样品取自海南省黎族自治县清水湾；试验所用0#柴油(密度为0.84 g/mL)购自中国石油天然气股份有限公司海南三亚销售分公司。
氯化钠(AR)、磷酸氢二钠(AR)和正己烷(AR)等试剂购自西陇科学股份有限公司，D2000 DNA Marker、2×Taq PCR Master Mix购自天根生物科技有限公司。
DGL-35B高压灭菌锅(上海力辰邦西仪器科技有限公司)、UV-5100紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)、Flexcycler多功能PCR仪(德国耶拿分析仪器股份公司)、Enduro GDS凝胶成像系统(深圳市赛进生物科技有限公司)等。
将海绵剪碎后置于无菌研钵中，并加入适量无菌海水，充分研磨后取上清液5 mL于质量浓度为5 g/L的100 mL柴油培养基中[10]，在28 ℃、180 r/min条件下富集5天，当培养基出现浑浊现象，取5 mL培养液转入100 mL新鲜的柴油培养基中，连续富集4次后，对降烃菌进行稀释涂布和纯化。
采用紫外分光光度法绘制柴油标准曲线[11]，以柴油质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线方程为y=0.009 3x+0.010 8，R2=0.999 2。接种体积分数为5%的菌液于5 g/L的柴油培养基中，28 ℃、180 r/min培养5天，以正己烷萃取培养基中残余的柴油，测定降解率。柴油降解率计算公式如式(1)所示[12]：
式中: R为柴油降解率, %; M为对照柴油质量浓度, g/L; N为实验柴油质量浓度, g/L。
以降解率为指标，优选降烃效果最佳的3株单菌株进行鉴定，如果3株单菌株种属相同，则鉴定降烃效果次之的单菌株，以此类推，直至选出3种菌株。采用菌落PCR技术扩增目标菌株16S rDNA基因序列，采用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3')进行扩增，将凝胶电泳后的扩增产物送至上海生工生物公司进行测序，参考高鹏飞等[13]的方法构建系统发育树。
对优选的3种菌株采用2种菌种或3种菌种复配，共计4个组合。用无菌生理盐水调节对数生长期的菌株至相同含量，从每个组合中取等体积的菌液分别加入4个100 mL柴油培养基中，培养条件和降解率的测定同第1.3.2节，并设置空白对照。选择降解率最高的组合作为优势菌群进行下一步试验，本试验设置3个重复。
为探索不同培养条件对降解率的影响，开展初始pH值、柴油质量浓度、转速和温度单因素试验，培养5天后测定降解率和细菌量(OD600)：①培养基初始pH值分别为5.6、6.4、7.2、8.0和8.8；②柴油质量浓度分别为10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L和50 g/L；③摇床转速分别为120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min和200 r/min；④培养温度分别为20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃。其他培养条件和柴油降解率的测定同第1.3.2节，本试验设置3个重复。
根据单因素试验结果，选取对降解率影响较大的3个因素作为自变量，以柴油降解率为响应值开展三因素三水平响应面试验，对所得结果进行多项式回归拟合及方差分析检验，得出各变量最佳参数，按照最佳参数进行验证试验以检验响应面分析的可靠性。
利用Microsoft Excel 2010软件对数据进行统计并作图，采用SPSS 19.0软件对单因素试验数据进行显著性分析，通过Design-Expert.V8.0.6.1软件分析和优化响应面试验结果。
经过稀释涂布法初步分离，筛选菌株38株(见图 1)，分别命名为D1、D2、D3……D38。其中，降解率超过40%的微生物有20株，降解率超过65%的微生物有3株，降烃效果最佳的3株菌株为D1、D7和D8，其降解率分别为65.70%、66.55%、70.53%。
对单菌株D1、D7和D8进行16S rDNA基因扩增与测序，利用Mega5.0软件的N-J法构建系统发育树(见图 2)。从发育树上可以看出，菌株D1与Halomonas属菌株Halomonas aquamarina strain 2PR52-11处于一个最小的独立分支，且自展支持率为99，并与该属其他物种处于相近却又不同的分支，由此可以鉴定菌株D1为Halomonas aquamarina物种；同理分析得D7为Sphingopyxis terrae 物种，D8为Marinobacter aquaeolei物种。
对D1、D7和D8开展复配试验(见表 1)。由表 1可知，复合菌系D1-D7-D8对柴油的降解率最高，因此，选取复配菌群D1-D7-D8进行后续的影响因素优化试验。
环境pH值影响微生物酶的活性，从而影响微生物对柴油的降解作用。由图 3可知，柴油降解率和OD600值随着pH值的升高呈现先上升后下降的趋势，其中，pH值=7.2时，降解率达到峰值74.81%。
图 4显示，降解率和OD600值随柴油质量浓度的增加先升高后降低。当柴油质量浓度为30 g/L时降解率达到峰值；柴油质量浓度从30 g/L升至50 g/L时，降解率急剧下降，分析原因可能是高质量浓度的柴油降低了微生物活性或者影响微生物生长。
由图 5可知，随着转速由120 r/min提高至160 r/min，组合D1-D7-D8的降烃效果逐渐升高，当转速为160 r/min时，柴油降解率随着溶解氧的升高而变大；当转速继续上升至200 r/min时，降解效果有所下降，可能是由于转速过高影响了细菌与碳源的接触情况；OD600变化趋势与柴油降解率相同。
温度会影响微生物的代谢活性。由图 6可见, 组合D1-D7-D8降烃的最佳温度为30 ℃，柴油的去除率达75%以上。当温度低于或高于30 ℃时，可能酶的活性降低，导致组合的降解率变小；OD600变化趋势与柴油降解率相同。
利用SPSS对单因素试验结果进行分析，选取对降解率影响较大的初始pH值(A)、柴油质量浓度(B)和温度(C)3个因素为自变量，各因子和水平情况见表 2。依据Box-Behnken设计原理进行了17次试验，结果见表 3。
对响应面试验结果进行回归拟合，由表 3可得出多元二次回归模型：Y=84.21+9.90A+3.75B+3.45C-0.19AB-1.26AC-3.78BC-18.21A2-5.74B2-8.02C2。由表 4可看出：其失拟项P值为0.057 9，大于0.050 0，说明该模型建立合理；模型的相关系数R2=0.980 5，表明柴油降解率的实际值与预测值之间拟合度较好。
响应曲面的坡度及等高线的偏离程度可反映两两因素间的交互作用，响应面坡度越陡，表明二者间的交互作用越显著，对柴油降解率影响越大，反之，越平缓则影响越小[14]。由图 7(a)可知，初始pH值和柴油质量浓度取适中值时，其降解率达到最大值，且过高或过低都会使降解率降低。由图 8(a)可知，初始pH值对降解率的影响较为显著，曲面变化幅度较大，当初始pH值与温度都较低时，降低了菌系的降解能力，不利于柴油的降解。从图 9(a)可看出，当柴油质量浓度较低且温度较低时，降解率最低。由图 7(b)、图 8(b)和图 9(b)可知，B与C交互作用显著，A与B、A与C交互作用不显著，这与回归方程模型的方差分析结果一致。
利用Design-Expert.V8.0.6.1软件对模型方程求解，预测最优条件初始pH值、柴油质量浓度、温度相应值分别为7.41、32.79 g/L、30.65 ℃时，其模型预测值为86.27%。根据实际情况，将柴油质量浓度和温度分别修改为32.80 g/L和30.70 ℃，其他条件不变。在此工艺下进行验证性试验，重复3次，得到降解率平均值为84.17%，与模型预测值吻合度较高，表明该模型可以较好地预测实际情况。
由于石油制品成分复杂，单一菌株难以完成对石油烃全组分的降解[15]，通过不同菌株间的共生和协同作用形成复杂的微生物菌系，可提高对石油烃类污染物的降解率，实现污染物的有效降解[16]。D1-D7-D8的柴油降解率高于其他组合，这是由于微生物之间存在协同关系。然而，目前对海洋柴油降解菌群的研究大多停留在简单的复配阶段。同时，仅依靠“柴油降解率”和OD600指标选定最优组合不太全面，微生物之间的相互作用及各菌株的降解特性有待进一步研究。
海绵动物净化海水不仅可以过滤海水中的悬浮物，还可以利用海绵体内微生物降解泵入其体内的海洋污染物。但是，由于海绵体内的微生物种类丰富，优势菌群可能不具有降解污染物的能力，或者对污染物的降解能力较差，不能针对性地降解某些污染物。本研究从海绵动物中筛选降烃微生物，为构建具有修复海洋柴油污染功能的海绵-降烃菌系共生体提供理论支撑，从而解决海水中柴油污染难以处理的问题，以期驯化优选菌系使其成为海绵动物体内的优势菌群，并形成稳定的共生体；将海绵-降烃菌系共生体置于海洋中，利用海绵自身泵水特性将含柴油污染物的海水泵入体内，促使柴油被共生体过滤吸附，实现降烃菌系与柴油的充分接触并降解柴油，从而修复柴油污染的海洋环境。此外，由于筛选的降烃菌来源于海绵动物，所以，其适应海绵提供的栖息环境，更易构建海绵-降烃菌系共生体。
(1) 从海绵动物中筛选出38株柴油降解菌，其中有3株细菌柴油降解率较高，对其进行鉴定得到D1为Halomonas aquamarina、D7为Sphingopyxis terrae、D8为Marinobacter aquaeolei。根据菌株复配后组合的降解率可得知，由D1、D7和D8组成的菌群组合降解率最高，5天后，柴油降解率达到74.86%。
(2) 在单因素试验的基础上，通过Box-Bchnken响应面法，对柴油降解率的影响条件进行了优化，发现对降解率的影响较大的3个因素为初始pH值、柴油质量浓度和温度；建立了回归模型，该模型预测得到最优条件初始pH值、柴油质量浓度、温度相应值分别为7.41、32.79 g/L、30.65 ℃时，其响应值降解率最大为86.27%，验证试验的降解率为84.17%。实测值和模型预测值相近，表明该模型可以较好地预测实际情况，同时丰富了海绵共生微生物的可降解烃菌株资源库，为解决海洋柴油污染的治理提供理论支撑。
2023, Vol. 52 Issue (1): 116-122 2023, Vol. 52 Issue (1): 116-122