石油与天然气化工  2024, Vol. 53 Issue (4): 106-110
引用本文
龚琪雯, 谢国彬, 黄燚, 廖一鸿, 符珉瑜. 硫酸盐还原菌检测方法研究进展[J]. 石油与天然气化工, 2024, 53(4): 106-110.   DOI: 10.3969/j.issn.1007-3426.2024.04.015
硫酸盐还原菌检测方法研究进展
龚琪雯 , 谢国彬 , 黄燚 , 廖一鸿 , 符珉瑜     
西南石油大学
收稿日期：2024-03-20
作者简介：龚琪雯，2004年生，西南石油大学本科在读，主要从事管道腐蚀、细菌检测等方面的研究。E-mail: 2158140050@qq.com.
摘要：国内外对硫酸盐还原菌（sulfate-reducing bacteria, SRB）已开展了众多测定方法研究，但这些方法应用条件各异，且普遍存在各方面限制，从而造成测量结果不精确的问题。本研究对硫酸盐还原菌的鉴定、量化和应用等方面的研究进展进行了综述，并分析其在各种情况下的应用情况。根据方法学的理论基础，主要基于细菌培养、遗传基因、特异性生物酶和生物传感器4大类原理，对SRB含量检测理论进行了分类，分析了其各自优缺点，并对其应用中面临的问题进行了剖析。同时，针对油气田中SRB评估与治理的现实需要，提出了硫酸盐还原菌含量测定与腐蚀活性监控技术的研究方向。
关键词：硫酸盐还原菌    SRB浓度检测    微生物腐蚀    腐蚀形态    
Research progress of sulfate-reducing bacteria detection methods
GONG Qiwen , XIE Guobin , HUANG Yi , LIAO Yihong , FU Minyu     
Southwest Petroleum University, Chengdu, Sichuan, China
Abstract: A lot of methodological studies have been carried out on sulfate-reducing bacteria (SRB) at home and abroad. However, these methods often have varying application conditions and limitations, leading to imprecise measurement results. This paper reviews the progress in the identification, quantification and application of sulfate-reducing bacteria, and analyse their application in various situations. According to the theoretical basis of the methodology, we classify the theory of SRB concentration detection, which is mainly based on the principles of four categories, namely, bacterial culture, genetic genes, specific bio-enzymes, and bio-sensors, and analyse their respective strengths and weaknesses, and analyse the problems faced in their application. On this basis, the research direction of sulfate-reducing bacteria content determination and corrosion activity monitoring technology is proposed in response to the real needs of sulfate-reducing bacteria assessment and management in oil and gas fields.
Key words: sulfate-reducing bacteria    SRB concentration detection    microbial corrosion    corrosion morphology    

硫酸盐还原菌（sulfate-reducing bacteria, SRB）是一种分布较广的兼性厌氧细菌，其以有机物或铁为电子供体，硫酸根为电子受体，可将硫酸根还原为H2S，并促使其发生化学、电化学等化学反应，从而对金属产生腐蚀[1-2]。

在工业中，SRB可能会导致设施和设备产生腐蚀，同时，它们的活性也可以被用来作为生物标志物，用于指示环境中的生物活性或评估环境的污染程度。因此，检测SRB对环境保护、工业过程控制及地质研究等方面都具有重要意义。

目前，稀释培养计数法（most probable number，MPN）、荧光传感器法、聚合酶链反应法、酶联免疫吸附法和电化学生物传感器法均已被用于SRB的检测。这些方法在实际应用中相辅相成，但也各有利弊[3-4]。如：MPN，使用可靠性高、但其操作繁琐、耗时多；基于特征代谢产物的检测方法操作简单、使用范围广、但仍存在耗时长的问题；基于细胞的检测方法则检测周期短，但在稳定性及特异性上需进一步提高；基于遗传标记的检测方法特异性强、灵敏度高，但检测成本较高、对专业技术人员的要求也较高[5]。因此，研究一种高灵敏性、高特异性的腐蚀微生物检测技术已成为一种迫切需求。

1 SRB含量检测方法研究

近年来，国内外针对SRB的检测研究持续深入，也形成了多种SRB检测方法，这些方法具有不同的特征，适用条件也存在差异。

1.1 MPN

MPN是基于培养反应理论的一种检测方法，也是目前油田上主要使用的方法，具有灵敏度高、检出限低等特点，并可根据检测结果对其它SRB检测方法进行校正。其原理是在含有硫酸根离子、以硫酸亚铁作为活性标志物的培养基内添加SRB样本。在SRB生长与代谢的过程中，将硫酸根离子还原成硫化物，最终在硫化物与硫酸亚铁指示剂的共同作用下产生沉淀[6]。该技术操作简便，费用低廉，是一种常用的SRB测定技术。

融化琼脂法是将待测样品稀释后加入到含有琼脂的培养基中培养，最终根据形成的黑色菌落数来推测样品中 SRB 的含量。

琼脂深层培养法是指将待测样品加入到半固态琼脂培养基中后，用矿物油及可以产生CO2的试剂密封，并在培养过程中记录培养基变黑的时间，绘制不同含量的 SRB 在培养基中变黑的时间的标准曲线，最终根据标准曲线推测样品中 SRB 的浓度。

此外，应用平板计数仪进行菌群密度测定时，可能会导致结果不准确。原因是细菌在被稀释后会互相粘附，生长时会发生交叠，所以在显微镜下观察到的菌群可能包含有两个或更多的细胞。另外，由于采用基于人眼观察的细菌种类鉴定方式，导致这种存在着很大的主观性。

以绝迹稀释法为主的形态测定法，适用于小型样本的实验室测定，具有操作简便、无需精密的仪器等优势，但该方法在敏感性和准确度方面上存在一些限制。

1.2 PCR检测技术

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）检测技术是一种对于特定的DNA片段进行放大扩增的分子生物学技术，其可在短时间内，对微量的DNA片段进行大量扩增，扩增后的DNA即可进行检测。该技术原理如图1所示。

图 1     聚合酶链反应（PCR）示意图

运用微生物遗传特征的分子生物学技术来辨识SRB的方法，主要包括了PCR技术、核酸片段结合法以及限制性片段长度多态性分析。

对于特定的目标生物SRB，常依赖的遗传标识物有16S rRNA的基因序列、独特的亚硫酸盐还原酶基因、及硫化物还原酶的基因序列[7].。

随着对SRB及其基因特征的深入研究，PCR法也在逐步发展。赵佳怡等[8]构建了 SRBddPCR分析方法。该方法以SRB的功能基因 dSRB为检测目标，优化了SRB ddPCR 技术的退火温度，最终构建了可以快速准确定量深部热水硫酸盐还原菌的微滴数字 PCR (droplet digital PCR, ddPCR)技术，并将该技术用于实际样品的检测。同时，一些学者还开发出了一种用于SRB的 PCR扩增技术，用于 PCR的快速定量分析。BEN-DOV等[9]开发出了一套针对 SRB中 dsrA、apsA等基因的荧光定量 PCR方法，该方法能更好地适应SRB的检出。魏利等[10]利用 APS还原酶的专一性，将 PCR与绝迹稀释法相结合，辅以电泳等手段，以此提高测定效率；但在−20~4 ℃环境下，培养基的保藏温度较低，使其难以普及。在此基础上，张伟等[11]通过对不同种属间 DNA的遗传变异进行研究，构建了可特异地对靶基因进行特异性识别和剪切的限制性片段长度多态性（restriction fragment lengthpolymorphism, RFLP）。

使用该检测技术需要注意的是：对SRB进行基因测序时依赖于该技术的敏感性和特异性。因此，在实验设计和引物选择上需要谨慎。同时，对于环境样品，由于可能存在其他共存微生物的DNA，会干扰PCR的特异性。故在实际应用中，通常需要结合专业严谨的操作步骤和数据分析，以确保测得的结果具有可靠性和准确性。

基因检测法可为了解SRB的分布和生态学角色、并评估其在环境中的影响提供有效的工具。总的来说，采用PCR等基因检测方法可快速、精确地检测出微量的细菌。但该类技术存在操作繁琐、费用较高及操作难度大等缺点。

1.3 代谢产物直接检测法

代谢产物直接检测SRB方法的原理是通过对SRB代谢产物的直接分析来进行鉴定和量化，主要包括硫离子选择电极法、三碘化甲基蓝法、还原酶测定法和放射性呼吸测定法。硫离子选择电极法是基于SRB的代谢过程中硫离子发生的量变，但在开放体系下检测时，会出现结果偏小甚至假阴性的检测结果。三碘化甲基蓝法是在MPN法的基础上，利用氧化还原反应使溶液变色而建立的检测方法[12]；还原酶测定法则通过检测亚硫酸还原酶（APS还原酶）酶量来检测SRB菌量，APS生物酶检测法是利用纯化抗体来检测5'-磷酸腺苷（APS）还原酶的存在，该种酶存在于所有SRB菌株中，纯化抗体附着于选择性地捕获APS还原酶的小颗粒上。检测时，这些颗粒和被捕获的酶将被隔离在多孔膜上，形成反应层。加入显色物质如存在APS还原酶后，反应层将显蓝色，颜色越深，代表SRB含量越高。上述方法均存在敏感度不高的问题。

另外，Maxwell[13]介绍了一种基于脱硫弧菌特有的重亚硫酸盐还原酶的检测方法，并对油田中的脱硫弧菌进行了检测。研究通过将脱硫弧菌细胞体内的重亚硫酸盐还原酶释放到溶液中，并改变溶液的pH，使该还原酶变性，变性后的重亚硫酸盐能够在 610 nm 处发射荧光，且荧光的强度与酶的含量呈正相关。因此，可以通过荧光检测法得到样品中SRB的种群数量，且整个检测流程只需几分钟 。

尽管目前已有的SRB代谢物分析技术可以在数小时之内获得分析结果，但由于溶解氧会导致硫化物和S2−被氧化。因此，该技术通常需要更严格的测试环境才能满足实际应用，且实际操作中也存在较多的限制。

1.4 基于生物传感器理论的检测方法

SRB含量生物传感器检测法是一种基于生物传感技术的方法，此方法通过构建特定SRB感知元件的生物传感器来实现对SRB含量的监测。电化学DNA传感器是一种利用电化学技术检测目标DNA分子的器件，通常由电极、探针、信号转换器和数据处理器组成。这些感知元件可以是对SRB产生特异性的生物分子（如抗体、酶或核酸适体），当感知元件与SRB发生特异性相互作用时，会引发一系列信号变化（如电流、电压或荧光强度的变化），通过监测这些信号变化，可以定量测定样品中SRB的含量。这种生物传感器检测法具有高灵敏性和实时监测的优势，在实际应用中对SRB含量进行快速而精准的检测[14]。

目前，有许多用于微生物检测的生物传感器件。在这些器件中，光学器件占相当大的比重。基于DNA、适配体和RNA等遗传物质的微生物检测生物传感器数量也逐渐增多。

该方法利用基因物质进行特异性识别，极大地提高了分析的灵敏度。此外，各学科的研究者们不断地在传感器中加入新的材料，以增强其识别准确性和适应能力。Qi等[15] 提出了一种基于ZnO阵列向ZnS阵列硫化转化的SRB特异性检测方法，该方法可对生物传感器进行改进。Wan等[16]在纳米信号标记的基础上，认为氧化锰纳米线和氧化石墨烯的应用具有提供信号标记物和增强信号的功能。贺子君等[17]基于Cd2+和Mn2+与SRB代谢产物S原子的反应，并结合连续离子层吸附与反应法，制备得到了光电流强度高、对SRB具有特异性、选择性和检测下限低至28 CFU/mL的 TiO2-NTs/CdS:Mn光电化学传感器。曾艳[18]构建了基于DNA 纳米生物条码-荧光系统的 DNA 生物传感器。

利用 DNA、适配体和 RNA 等遗传物质检测微生物的生物传感器数量正在逐渐增加。这是因为使用遗传物质作为敏感材料可以实现高选择性并显著提高检测灵敏度。然而，这类检测材料的高成本和复杂性是其可被广泛应用的障碍。

2 各种检测法优缺点

根据上述分析，并基于各种原理形成的SRB含量检测方法的优缺点见表1。

表 1    各种检测法及其优缺点 Table 1    Assays and their advantages and disadvantages

3 结论与建议
3.1 结论

1） 绝迹稀释法对设备要求低、操作简单、但检测周期长，且无法完全反映现场的实际情况，只能达到常规现场检测的一般要求。

2） 代谢产物直接检测法对设备要求低、分析结果时间较快，但需要先将样本进行富集浓缩处理，以达到实验室和现场的检验需求。

3） PCR检测法具有精度高、稳定性好和测定时间短等优点，但对试验仪器要求高。

4） 基于生物传感器理论的检测方法具有高灵敏性和实时监测的优势，但检测材料的成本较高。

3.2 建议

1） 检测设备装置方面。①针对各种检测手段存在的明显缺陷开展相关研究，着重解决如何缩短培养时间、提高检测精度、降低检测下限等问题；②在微纳米技术的基础上，继续研制可携带式SRB探测一起，以此提高测试设备的微型化和轻量化；③关注SRB类电化学生物传感器的应用研究，筛选出稳定可靠、低功耗和便于携带的SRB检测新技术；④利用功能齐全的数据处理软件，尽可能地实现对样品的采集、处理、放大和输出的全自动处理。

2） 现场实际运用方面。可开展相关技术的工程实践研究，研制适用于野外复杂工况的监控设备，保证其在气-液两相流工况下的工作可靠度与监控稳定性，并构建实时监控结果与监控信息的分析体系。同时，可进一步提高腐蚀监测的数字化水平，以加快实现生产现场的SRB腐蚀活性监测，为提高SRB腐蚀预测水平和在线评价杀菌效果提供先进的技术手段。

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