油井采出液中含有原油、水、各种添加剂以及机械杂质等多种组分[1]。其中，H2S气体的存在对油田造成了严重的危害[2]。H2S不仅会导致生产系统的金属部件腐蚀[3-4]，还可能引发H2S中毒事件[5-7]。
地层中产生H2S的原因很多，在注水开发过程中，微生物还原作用是产生H2S的一个重要原因[8-9]。油田常采用绝迹稀释法来检测SRB含量，但该方法通常需要较长的培养时间，且提供的数据信息较为有限[10]。为了深入了解微生物在注水采油生产系统中对H2S产生的影响，需要对微生物的种类和功能进行详细分析。近年来，高通量测序分析在研究复杂环境微生物群落组成和相对丰度方面发挥了重要作用[11]。这一技术的应用，将有助于研究人员更深入地了解微生物在注水采油过程中的作用，并为油田安全生产提供科学依据。NovaSeq 6000基因组测序仪作为Illumina目前推出的最为先进的测序仪，具有高通量、高灵活性的测序优势，可以满足复杂环境下的多种基因测序需求[12]。
关于油藏中微生物多样性的报道主要是针对油藏中对采油有益的微生物进行分析，以此作为评价采用微生物方法提高采收率的依据[13]。然而，关于“注水−采油”系统的微生物多样性情况尚不明确，直接影响了对H2S成因的深入理解。此外，越来越多的证据显示：自然环境中的微生物群落功能组成与环境因子密切相关，而非物种组成。这进一步表明除了了解环境中存在的微生物种类外，揭示微生物群落的功能轮廓同样至关重要[14-15]。
目前，基于marker基因扩增子高通量测序的功能预测是经济有效地反映微生物群落功能特征的方法。其中，FaPROTAX是通过将原核生物的功能进行外推，以估计其代谢或其他生态相关功能的数据库，更适用于生物地球化学循环（特别是碳、氢循环）的功能注释和预测（氮、磷、硫），在环境样本的微生物测序中已得到广泛认可[16]。
本研究的目的在于，通过群落多样性组成和功能分析，确定油田含硫区块“注水−采油”系统SRB的分布及菌群功能结构，并结合水质分析数据为H2S源头控制技术开发提供技术参考，以期实现油田安全生产的优化。
自2017年以来，靖边采油厂杨米涧区块采出液中存在H2S的问题日益突出，其中大红高粱开发单元的情况最为严重。然而，由于技术水平的限制，该区块并未采取有效的治理措施，导致金属管柱（包括井筒、注水井、输油管线等）和地面设备遭受严重腐蚀。从开发层位来看，该区块的H2S问题主要源于延9层的地层。开发层位为延9层的油井深度普遍在1000 m以上，地层温度为30~45 ℃，这种环境条件较为适宜微生物的生存。本研究选取了靖边杨米涧区块的天赐湾联合站进出水和该站对应的油井、注水井（高含硫注采系统全流程）作为研究对象，同时选取长6层油井（不含硫）和胜85撬装站的进出水（含硫）作对比。对生物相高通量测序（NovaSeq 6000），并采用FAPROTAX进行微生物功能预测。研究区域的地理位置及取样点分布如图1所示。图1中红色点位为高含硫注采系统中的取样点，蓝色点位为对照取样点位。
各取样点在“注水−采油”系统流程中的位置、水质组分分别如图2和表1所示。
“注水−采油”系统利用抽油机将原油从油藏中采出，由于原油中含有一定比例的水，因此被称为“采出液”。之后，含水的原油被输送至具有油水分离功能的场站进行分离处理。分离出的原油被送至炼油厂进行炼制；分离出的水在输送至水处理站处理后，经注水井回注油藏用于增能。取样分析点位选取在油井井口（①）、油水分离罐出口（②）、水处理站出水（③）、注水井（④），见图2。将这些取样点分为5个组，分别为延9层含硫区域油井（R1）、延9层非含硫区域油井（R2）、中低含硫水处理站进出水（R3）、高含硫水处理站进出水（R4）和延9层含硫油井区域注水井（R5）。其中R1、R2、R5属同一套注水−采油系统，R2、R3为对照组取样点。
采用 CTAB / SDS 方法对样本的基因组 DNA 进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和含量，取适量的样本DNA于离心管中，用无菌水将样本质量浓度稀释至1 ng/μL。
以稀释后的基因组 DNA 为模板，根据测序区域的选择，使用带 Barcode 的特异引物，New England Biolabs 公司的 Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效、高保真酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。
采用16S V4区引物（515F和806R）对样品进行16S rRNA基因PCR扩增。
PCR产物使用质量分数为2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测；对检测合格的PCR产物进行磁珠纯化，采用酶标定量，根据PCR产物含量进行等量混样，充分混匀后用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。
使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用NovaSeq 6000进行上机测序。FAPROTAX对采出液样品核心微生物群进行功能注释预测。
H2S含量采用HJ/T 60—2000 《水质 硫化物的测定 碘量法》检测。
OTU生产序列分析采用Uparse软件进行分析。相似性≥97%的序列归为相同的OTUs。筛选每个OTU的代表性序列进行进一步注释，OTUs信息及α多样性指数如图3所示。从图3可知，OTUs和α多样性指数（Shannon指数和Chao1指数）随着采出水在油田地面的运移呈现下降趋势，其中油井的Shannon指数和Chao1指数分别为5.70~7.35和857.1~1887.8，管输和水处理段Shannon指数和Chao1指数分别为4.43~6.40和636.9~839.3，注水中的Shannon指数和Chao1指数分别为3.54~3.77和515.6~519.1。这表明油井样品的生物多样性明显高于管输段和水处理段，而注水样品的生物多样性指数最低。
含硫油井（O.3.1、O.3.2、O.4.1、O.4.2）样品的Chao1指数为1327.6~1887.8，不含硫油井（Y.1）的Chao1指数为857.1，表明含硫油井的生物多样性显著高于不含硫油井。在管输和水处理系统中，高含硫采出液样品（T.1、T.2）的Shannon指数为4.43~5.52，低含硫采出液样品（S.1、S.2）的Shannon指数为5.69~6.40，说明低含硫采出液中的生物多样性更高。
对于每个具有代表性的序列，采用基于Mothur算法的Silva Database对分类信息进行注释。各取样点位的门水平和属水平上的生物种类分布如图4所示。由图4可知，各取样点位在门水平上差别不大，除O.4.2外，门的种类普遍为21~27。而在属水平上，油井的物种种类（290~343）要多于后续油气输送系统（200~253）、水处理系统出水（272~277）和注水（201~207）。
主坐标分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA）是一种通过一系列的特征值和特征向量排序从多维数据中提取出最主要的元素和结构的方法。样品距离越接近，表示物种组成结构越相似，群落结构相似度高的样品倾向于聚集在一起，群落差异很大的样品则会远远分开。
通过主坐标分析方法确定各样品之间的β微生物多样性，结果如图5所示。从图5可知，油井采出水样品主要分布在左侧，而集输系统、水处理站、注水井样品则主要分布在右侧。O.4.1、O.4.2、O.3.2、Y.1采出水样品较为分散地分布在图5中的左下侧，O.3.1采出水样品在图5中的左上侧，距离其他油井采出水样品较远的位置，说明在复杂的地层环境下，油井样本微生物群落结构差异较大。
随着采出水在地面系统中的运移，其生物群落结构发生了较大的变化，表现为T.1与T.2和S.1与S.2的差异性减小，S.1、S.2和T.1、T.2样品的差异性同样减小到较低水平，注水样品W.3.1和W.4.1之间的生物群落相似度则相对较高，表明通过集输系统和水处理系统之后，注水中的微生物群落结构大体趋于一致。
通过NovaSeq6000测序，不同取样点位的微生物群落结构如图6和图7所示。在门的分类水平上，脱硫菌门（Desulfobacterota）在含硫油井采出液中占比较高，为16.7%~43.0%，而不含H2S采出液的油井（Y.1）中脱硫菌门仅占4.8%，变形菌门（Proteobacteria）与厚壁菌门（Firmicutes）在所有油井中均有较高的占比。
在集输系统、水处理系统和注水中，弯曲菌门（Campylobacterota）都是优势菌群，占比为28.0%~63.4%，说明随着输送过程中水质与溶解氧的变化，菌群结构发生了较大改变。脱硫菌门在集输系统和水处理系统中的占比显著降低，为7.9%~18.6%，注水中则几乎不含脱硫菌，表明SRB在地层温度适宜的厌氧环境中大量繁殖。
SRB主要有脱硫杆菌属（Desulfomicrobium）、三氯单胞菌属（Trichloromonas）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、脱硫单胞菌属（Desulfuromonas）和脱硫球菌属（Desulfococcus）[17-21]。在含硫油井采出水中，SRB的优势菌为脱硫杆菌属（占比10.4%~38.2%）、三氯单胞菌属（在O.3.1中占比11.1%）和脱硫弧菌属（占比2.3%~11.5%）；在非含硫井的采出水中，SRB仅占3.5%，以脱硫杆菌属为主，占比为2.2%。随着采出水在注采系统中的迁移，SRB占比呈现递减趋势。天赐湾水处理站水样SRB占比由油井中的28.0%降至8.9%，而注水中的SRB均值仅为2.1%，水处理站和注水井水样中的SRB均以脱硫杆菌属为主。作为对照组的胜85撬装水处理站水样中SRB的平均值为9.4%，与天赐湾水处理站接近，但优势SRB除脱硫杆菌外，还有较多的脱硫单胞菌属和脱硫球菌属细菌。
硫氧化菌主要有硫氧化单胞菌属（Sulfurimonas）、硫碱微球菌属（Thioalkalimicribium）、磺螺菌（Sulfurospirillum）[22-24]。硫氧化单胞菌属和磺螺菌属同时具有硫氧化和反硝化功能[25]，在油井采出水样品中的占比非常低，为2.9% ~ 4.8%。然而，当采出水经过集输和注水段时，这些细菌却变成了优势菌种，占比高达16.2% ~ 60.9%。这说明随着采出水逐渐暴露在空气中，硫氧化单胞菌迅速繁殖，并逐渐占据主导地位。在采出水环境中，尽管具有硫氧化作用的硫碱微球菌属在O.3.1、O.3.2菌群中占比分别达到12.0%和15.2%，但由于该类菌是自养菌，代谢缓慢，因此在地层环境中整体硫氧化代谢作用较弱[23]。磺螺菌属在胜85撬装站S.1和S.2水样中的占比分别为4.8%和5.6%，在油井采出水、天赐湾联合站及其注水水样中的占比则较低（＜1.7%）。这是由于胜85撬装站采用露天油水分离系统和气浮作为主要处理设备，与空气接触较多，溶解氧含量相对较高；天赐湾联合站油水分离系统密闭性较好，且采用密闭沉降罐作为主要水处理设备，进入水中的溶解氧总量少。而磺螺菌属细菌较适宜生存在微氧环境中，因此造成了两个水处理站硫氧化菌群落结构的差异。
由图7还可知，假弓形杆菌属（Pseudarcobacter）菌种在油井采出水和注水井中含量较低，但在水处理站中大量繁殖。目前，对于该菌属的功能方面的研究较少，大部分关于本属的研究都停留在分类命名阶段[26]。根据目前研究结果推测该菌种与硫氮共代谢以及疾病产生[27-28]有关，且其活性变化与介质环境中${\mathrm{SO}}_4^{2-} $含量变化有较密切的联系[29]。
基于QIME软件进行微生物FAPROTAX功能预测，结果如图8所示。由图8可知，各样品中菌群功能最强的是化能异养、发酵作用等碳氢化合物降解功能（柱状图中黑色部分），其次为含硫化合物的还原作用（红色部分）。含硫化合物的还原作用与菌群中的脱硫菌门的变化趋势基本一致，硝酸盐还原作用（绿色部分）在部分样品的群落功能中也占据较高比例。
值得注意的是，尽管O.3.1油井水样中的${\mathrm{SO}}_4^{2-} $质量浓度达到1104.6 mg/L，且溶解氧质量浓度低至0.1 mg/L以下，SRB丰度也较高，具备充足的硫酸盐还原条件，但根据FaPROTAX分析结果，该水样的硫酸盐还原作用并不明显，仅占总菌群功能的3.6%。推测可能是由于NRB较强，在与SRB的底物竞争中占据主导地位。O.3.1油井水样中的NRB主要包括硫氧化单胞菌（占比1.5%）、假单胞菌（占比1.5%）、盐单胞菌（占比11.9%）、芽孢杆菌（占比2.5%）、韦荣氏球菌（占比1.35%）、简易螺旋菌（占比0.2%）、赖氨酸芽孢杆菌（占比1.75%）等，总计占比达到20.7%，成为菌群中的优势菌种，导致SRB受到严重抑制。在FaPROTAX预测分析结果中，硝酸盐还原作用占比为8.2%，达到硫酸盐还原菌的2.3倍以上。这表明通过提高注水中硝酸盐的含量抑制硫酸盐，从而降低地层中H2S含量的方案是可行的。
为了研究NRB对SRB的抑制作用，对不同区块的延9层含硫井和非含硫井采出水进行了采集和对照分析，结果如图9所示。由图9可知，油井采出水中硫化物的含量随着硫酸盐含量的降低而逐渐减少，这表明硫化物的生成与地层中硫酸盐的含量呈正相关。
此外，当油井采出水中硝酸盐质量浓度较低（0~5 mg/L）时，硫酸盐容易被还原为硫化物，平均硫化物质量浓度为466.7 mg/L。然而，当采出水中硝酸盐质量浓度达到40 mg/L以上时，硫酸盐几乎不被还原。以上结果表明，硝酸盐的存在对硫酸盐的还原作用具有显著的抑制效果。
图10为不同层位温度对硫酸盐还原作用的影响。采出水分别来自延9层和长2层。根据地质勘探资料，靖边采油厂延9层的地层温度通常为34.3~42.6 ℃，长2层的地层温度为41.4~52.2 ℃。从图10可看出，延9层的地层温度更适宜中温环境菌种的生长。在该区块，延9层油井采出水中含有较高的脱硫杆菌属、三氯单胞菌属、脱硫弧菌属等硫酸盐还原菌，均为中温生长菌种[17,30-31]。在较高的温度下，SRB受到较严重的抑制作用，因此，H2S质量浓度显著低于延9层（2.5~25.4 mg/L）。这也是杨米涧区块延9层H2S含量显著高于其他层位的原因。
由于杨米涧区块的采出水回注远不能满足补充地层能量的需求，因此需要配注大量清水。该区块配注清水均来源于洛河组地下水源井。图11为延9层位不同水处理站配注清水的情况。由图11可知，含硫生产区域配注清水的硝酸盐质量浓度较低（＜10 mg/L），而不含硫生产区域的配注清水中硝酸盐质量浓度则达到40 mg/L以上。这表明经过长期配注硝酸盐质量浓度为40 mg/L以上的清水，可以显著抑制SRB的作用，从而减少H2S的产生，保障现场安全生产。
1） 含硫注采系统微生物α多样性分析结果表明，含硫油井的生物多样性明显高于不含硫油井和后续集输、水处理、注水阶段的水样。
2） 含硫注采系统微生物β多样性分析结果表明，油井采出液中微生物物种差异性较大，而通过集输系统和水处理系统之后，注水中的微生物大体趋于一致。
3） 微生物群落结构分析结果表明，脱硫菌门微生物随着采出液的运移而逐渐降低，说明SRB在温度适宜的厌氧地层环境中大量繁殖。属水平菌群结构分析结果表明，具有硫酸盐还原作用的优势菌为脱硫杆菌属、三氯单胞菌属和脱硫弧菌属。
4） 油井中硫酸盐还原作用与菌群中脱硫菌数量的变化趋势基本一致，但在采出液中存在较强的硝酸盐还原作用时，含硫化合物还原作用受到明显的抑制。
5） 长期配注硝酸盐含量较高的清水，能有效抑制SRB，减少H2S的产生，保障油田现场的安全生产。
2024, Vol. 53 Issue (6): 80-87 2024, Vol. 53 Issue (6): 80-87